尖锐湿疣：诊断

　　醋酸白试验

 

　　用-%醋酸外涂疣体-分钟病灶部位变白稍隆起肛门病损可能需要分钟本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同只有前者才能被醋酸脱色醋酸白试验检测HPV的敏感性很高它比常规检测观察组织学变化还好但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性假阳性变白迹象显得界限不清和不规则美国CDC提示醋酸白试验并不是特异试验且假阳性较常见

 

　　免疫组织学检查

 

　　常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP）显示湿疣内的病毒蛋白以证明疣损害中有病毒抗原HPV蛋白阳性时尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应

　

　　组织化学检查

 

　　取少量病损组织制成涂片用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色如病损中有病毒抗原则抗原抗体结合在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中核可被染成红色此法特异性强且较迅速对诊断有帮助

　

　　病理检查

 

　　主要为角化不全棘层高度肥厚乳头瘤样增生表皮突增厚延长其增生程度可似假性上皮瘤样刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂颇似癌变但细胞排列规则且增生上皮和真皮之间界限清楚其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成此种空泡细胞较正常大胞浆着色淡中央有大而圆深嗜碱性的核通常真皮水肿毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣表皮极度向下生长代替了其下面的组织易与鳞状细胞相混故须多次活检若有缓慢发展之倾向 则为种低度恶变的过程即所谓疣状癌

 

　　基因诊断

 

　　迄今HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测主要实验诊断技术是核酸杂交近年来发展的PCR方法具有特异敏感简便快速等优点为HPV检测开辟了新途径

 

　　（）标本的采集及处理

 

　　．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞在作细胞学检查的同时将标本放入ml含有.%硫柳汞的PBS中用PBS离心（gmin）洗涤次沉积细胞重悬于mlPBS中取.ml细胞悬液抽提DNA

 

　　．标本核酸的提取：按体积细胞悬液加倍体积的细胞裂解液（mmol/L Tris-HClpH .mmol/L EDTAmmol/L NaCl.%SDS.mg/ml蛋白酶K）℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(:)氯仿/异戊醇（:）各抽提次；加/体积mol/L NaAc（pH .）及.倍体积无水乙醇置-℃ h或过夜沉淀DNA；加体积乙醇洗涤次；用μl含RNA酶(μg/ml)的TE液(mmol/L Tris-HClpH ..mmol/L EDTA)溶解DNA℃温育min

 

　　（）PCR扩增

 

　　．  引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L）每区含系列开放读码框架（ORF）序列分析表明各型HPV的非编码区及EEE和L区均有保守序列Manos等从HPVL区中选择保守序列设计合成引物MY和MY见表该引物与HPV 及型有互补序列也可扩增其它型HPV

 

　　Manos等设计的HPVL通用引物

 

　　MY：GCMCAGGGWCATAAYAATGG

 

　　MY：CGTCCMARRGGAWACTGATC

　　

　　表

HPV型	MY的第个硷基位置	MY的第个硷基位置	PCR产物长度（bp）

　　 M=A+C R=A+GW=A+TY= C+T

　　

　　表列述了Manos等设计的寡核苷酸探针公用混合探针序列选自HPVL区中另保守序列可与       MY和MY引物产生的多种HPVL PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列用于检出的HPV分型

　　

　　表   Manos等设计的HPVL PCR产物探针

公用混合探针

GP   CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC

GP  CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC

第个硷基位置

HPV                     HPV                            HPV

HPV                    HPV

                           

探针

             

HPV型

             

序列

             

基因位置

             

MY

             

HPV

             

CATCCGTAACTACATCTTCCA

             

—

             

MY

             

HPV

             

TCTGTGTCTAAATCTGCTACA

             

—

             

MY

             

HPV

             

CATACACCTCCAGCACCTAA

             

—

             

MY

             

HPV

             

GGATGCTGCACCGGTCTGA

             

—

             

MY

             

HPV

             

CACACAAGTAACTAGCTACAG

             

—

　　                                                       H=A+C+TR=A+GW=A+TY=C+T

 

　　．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（U/ml）mmol/L dNTP贮备液（dATPdCTPdGTPdTTP各mmol/L）×PCR缓冲液(mmol KClmmol/L MgClmmol/L Tris-HClpH .)μmol/L MY和MY贮备液灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水

 

　　．PCR扩增方法和程序：以μl PCR反应液,用无菌.ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应

 

　　（）实验前配制预混反应试剂并分装预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂每支反应管中含有的PCR反应试剂见表

 

　　表    每支反应管中的PCR反应试剂

反应试剂	体积（μl）	终浓度
×PCR缓冲液		×PCR缓冲液
dNTP贮备液		μmol/L每种dNTP
MY贮备液	.	μmol/L
MY贮备液	.	μmol/L
Taq DNA聚合酶	.	.μ
灭菌蒸馏水	.
总计	.

 

　　（）各反应管依次加入μl标本和μl预混反应试剂

 

　　（）加入-μl石蜡油在台式离心机上快速离心数秒钟使各反应试剂收集于油层下目前PCR试剂已商品化反应体积为μl使用时只加入标本DNA即可

 

　　（）将反应管置PCR扩增仪上循环参数为℃ s℃ s℃ s循环次最后℃延伸min

 

　　．每次试验应设阳性及阴性对照以载有HPV的重组质粒（每反应为pg）或含有HPV的细胞系（如CaskiHeLa）DNA为阳性对照以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照

　　

　　（）扩增产物的检测和分析

 

　　．  凝胶电泳：扩增反应结束后取出反应管冷却至室温取μl扩增产物用%-%聚丙烯酰胺凝胶或.%琼脂糖电泳溴化乙锭染色紫外分析仪下分析结果分子量约为bp处出现明显的DNA带

 

　　．  核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交斑点杂交验证

 

　　按照标准方法制P ATP标记的寡核苷酸探针需达到约cpm/pmol特异活性杂交液中需含有×-×cpm探针/ml在℃缓慢振荡下杂交-h随后于-℃下用洗涤液（×SSC.%SDS）迅速冲洗杂交膜除去多余探针然后进行洗膜其条件依所用探针而异：公用混合探针℃洗膜min；MYMY及MY探针-℃下 min并换液重洗次；MY及WD探针-℃下min亦换液重洗次

　　

　　用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越其敏感性高GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果可检出标本中个拷贝的HPV DNA若以核酸杂交检测PCR产物敏感性提高能检出个拷贝的HPV DNA

鉴于PCR技术的高度敏感性以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求避免了活检取材研磨组织繁杂操作般情况下PCR扩增产物经凝胶电泳观察产生的DNA可直接作出诊断因此PCR技术检测HPV实验周期短简便快速